Method Article

Progettazione e Realizzazione di un Illuminating automatizzato, Coltura, e di campionamento per microbica optogenetic Applicazioni

DOI:

10.3791/54894

⸱

February 19th, 2017

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbiamo progettato una apparecchiatura per le colture in continuo per l'uso con i sistemi optogenetic per illuminare le culture di microbi e regolarmente celle di immagine negli effluenti con un microscopio invertito. La coltura, il campionamento, l'imaging, e l'analisi delle immagini sono completamente automatizzati in modo che le risposte dinamiche a illuminazione possono essere misurati per diversi giorni.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

sistemi optogenetic utilizzano proteine ​​geneticamente codificate che cambiano conformazione in risposta a specifiche lunghezze d'onda della luce per alterare i processi cellulari. Vi è la necessità per la coltura e misurare sistemi che incorporano programmati illuminazione e la stimolazione dei sistemi optogenetic. Vi presentiamo un protocollo per la costruzione e l'utilizzo di una apparecchiatura per le colture continua ad illuminare le cellule microbiche con dosi programmate di luce, e automaticamente acquisire e analizzare le immagini delle cellule nell'effluente. Il funzionamento di questo apparato come chemostat permette il tasso di crescita e l'ambiente cellulare per essere strettamente controllate. L'effluente della coltura cellulare continua è regolarmente campionata e le cellule vengono esposte mediante microscopia multicanale. La coltura, il campionamento, l'imaging, e l'analisi delle immagini sono completamente automatizzati in modo che le risposte dinamiche l'intensità di fluorescenza e la morfologia cellulare delle cellule campionate dal dell'effluente cultura sono misurati su più giornisenza l'input dell'utente. Abbiamo dimostrato l'utilità di questa apparecchiatura per le colture inducendo dinamicamente produzione di proteine in un ceppo di Saccharomyces cerevisiae progettato con un sistema optogenetic che attiva la trascrizione.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sistemi optogenetic utilizzano la luce per controllare un numero crescente di processi cellulari tra espressione genica, 1, 2, 3, 4, 5 localizzazione proteine, l'attività della proteina 6, 6, 7, 8 vincolante proteine, 8, 9, 10 e degradazione delle proteine. 11 Un metodo per coltura di cellule in un ambiente controllato con la stimolazione ottica programmata e per misurare la loro risposta su scale temporali biologicamente rilevanti è necessaria per sfruttare le potenzialità di questi strumenti per la ricerca in biologia cellulare e delle biotecnologie. Il nostro metodo si avvale di chemostasis a mantenere un tasso di crescita costante di cella in un ben miscelato, aevalutazione, e termostatato recipiente di vetro coltura 12, 13 che è esposto all'illuminazione programmato. Noi immagini singole celle nell'effluente coltura con un microscopio invertito per misurare la risposta della cultura all'illuminazione programmato. La coltura, il campionamento, l'imaging, e l'analisi delle immagini sono completamente automatizzati in modo tale che l'intensità di fluorescenza e la morfologia cellulare della coltura cellulare effluente può essere misurata su più giorni senza l'input dell'utente.

Questo protocollo può essere implementato in molti laboratori familiarità con crescente coltura cellulare e microscopia, e l'apparecchiatura utilizzata è poco costoso e fatto di componenti prontamente disponibili. Un recipiente di coltura trasparente è posizionato sopra una matrice di diodi emettitori di luce (LED) in grado di emettere 1 W / cm 2 -10 mW / cm 2 di luce. I microbi sono coltivate nel recipiente di coltura in continuo; una pompa peristaltica viene utilizzata per aggiungere media alladiluizione, un'altra viene utilizzata per prelevare cultura ad un tasso minore al microscopio, e la differenza sfugge attraverso un'uscita di overflow. Una piastra elettrica mantiene la temperatura. L'aria viene continuamente pompata nel recipiente di coltura per mantenere una pressione positiva nonché per mescolare ed aerare la cultura. Fatta eccezione per la pompa di aria, il potere di questi dispositivi è regolato da un microcontrollore che riceve anche input da un termometro e un computer desktop collegato. La coltura cellulare effluente viene pompata ad un dispositivo microfluidico sulla scena di un microscopio invertito. Non fluorescente e le immagini fluorescenti vengono acquisite automaticamente. Le cellule nelle immagini sono caratterizzati da un algoritmo che individua ciascuna cella come una regione di interesse (ROI) e misura le proprietà di ogni ROI.

Per dimostrare l'applicazione di questo protocollo, abbiamo misurato la risposta alla luce diverse intensità di cellule di Saccharomyces cerevisiae ingegnerizzate con un respon luce bluve sistema optogenetic che controlla la trascrizione della proteina fluorescente. S. cerevisiae, comunemente noto come lievito di birra, è stato scelto perché più sistemi optogenetic per controllare l'espressione genica in questo sistema esistono già 14, 15, 16. Inoltre, questo organismo modello è comunemente utilizzato per studi in biologia dei sistemi 17 e come telaio per applicazioni biotecnologiche 18, 19, 20. I nostri risultati rappresentativi dimostrano che questo protocollo può essere utilizzato per controllare la trascrizione di una cultura su più giorni variando intensità di luce di ingresso e misurando la produzione di un reporter fluorescente.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

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Figura 1: L'apparecchiatura per le colture continuo. Questo schema semplificato mostra come l'apparecchio deve essere montato quando viene utilizzato per la cultura, illuminare, e misurare le proprietà ottiche dei microbi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Panoramica del protocollo. I passi della regione ombreggiata deve essere ripetuta ogni volta che il protocollo è utilizzato. Controllo ad anello chiuso è possibile 34, ma non è implementato in questo protocollo.

1. Montare il termometro al circuito


Figura 3: Collegamenti per leggere i valori termometro. Questo diagramma mostra come il termometro digitale dovrebbe essere collegato al circuito stampato in modo che il microcontrollore può ottenere un feedback per controllare la temperatura della cultura. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
  1. Saldare la terra, dati, e le linee di tensione positiva del termometro digitale per i loro rispettivi fori passanti contrassegnati con "GD + V".
  2. Clip fuori un passaggio di un colpo di testa a 3-pin femmina e tagliare i restanti 2 perni con i tagliatori di filo, in modo tale che può andare bene nei due fori passanti etichetta "R2" e non ostacolare il microcontrollore. Saldare questo posto. Collegare i due perni saldati inserendo una resistenza da 4,7 kΩ nell'intestazione pin.

2. Collegare l'alimentazione ConComponenti trollo al circuito

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Figura 4: Connessioni per controllare il potere al pad di riscaldamento. Questo diagramma mostra come le parti di PCB e accessori devono essere assemblati in modo da controllare la potenza al pad di riscaldamento. Le parti per controllare le pompe peristaltiche sono collegati in modo simile. Si noti che i componenti per il termometro sono state rimosse per chiarezza. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Tagliare 1 cm dai pin di cinque donne intestazioni a 3 pin. Saldare questi per le posizioni sulla scheda a circuito stampato (PCB) contrassegnato come "# 1", "# 2", "# 3", "# 4" e "CB E."
  2. Tagliare 1 cm dai pin di un colpo di testa a 6 pin e 8-pin femmina. Saldare questi fianco a fianco perla colonna di fori passanti etichettato K1 attraverso K14.
  3. Collegare il rilievo di riscaldamento per il circuito.
    1. Inserire le estremità di un resistore 100 k nel K1 fori passanti etichettati e K2 sul PCB. Inserire un transistore metallo-ossido-semiconduttore ad effetto di campo (MOSFET) nella posizione contrassegnata 1 # sul PCB, con l'etichetta del MOSFET rivolta verso la K1 attraverso K14 fori passanti in modo che il perno di origine è più vicino al "# "label, e il perno di scarico è più lontana dalla" etichetta # ".
    2. Tagliare la linea di terra della corrente di cavo di alimentazione 5 V continua (DC) e collegarlo a J2. Collegare la linea di terra della piastra elettrica per J1. Collegare K3 al pin 3 con una resistenza da 1 k. Corrente dovrebbe ora fluire solo da J1 a J2 quando il pin 3 è impostato a + 5V.z
      NOTA: Le funzioni impostate resistore / MOSFET come un interruttore che consente alla corrente di fluire dal pin J1 J2 quando il pin 3 del microcontrollore è impostato a +5 V.
  4. Collegarela pompa peristaltica lento.
    1. Inserire le estremità di un resistore 100 k nel K4 fori passanti etichettati e K5 sul PCB. Inserire un MOSFET nella posizione contrassegnata 2 # sulla PCB, con l'etichetta del MOSFET rivolta verso la K1 attraverso K14 fori passanti in modo che il perno di origine è più vicino all'etichetta "#", e il perno di scarico è più lontana dalla etichetta "#".
    2. Tagliare la linea di terra del cavo di alimentazione 12 V DC della pompa peristaltica lento. Collegare la pompa peristaltica di fronte alla fine J3 e la verruca parete di fronte alla fine J4. Collegare K6 al pin 4 con una resistenza da 1 k. Corrente dovrebbe ora fluire solo da J3 a J4 quando il pin 4 è impostata a +5 V.
  5. Collegare la pompa peristaltica veloce
    1. Inserire le estremità di un resistore 100 k nel K7 fori passanti etichettati e K9 sul PCB. Inserire un MOSFET nella posizione contrassegnata 3 # sul PCB, con l'etichetta del MOSFET rivolta verso la K1 attraverso K14 fori passanti s o che il perno di origine è più vicino all'etichetta "#", e il perno di scarico è più lontana dalla etichetta "#".
    2. Tagliare la linea di terra del cavo di alimentazione 12 V DC della pompa peristaltica veloce. Collegare la pompa peristaltica di fronte alla fine J5 e la verruca parete di fronte alla fine J6. Collegare K9 al pin 5 con una resistenza da 1 k. Corrente dovrebbe ora fluire solo da J5 a J6 quando il pin 5 è impostato a +5 V.

3. Collegare la matrice di LED al circuito

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Figura 5: Connessioni per controllare la matrice di LED. Questo diagramma mostra come la matrice di LED deve essere collegato al PCB. Essa mostra inoltre che il PCB può essere impilata sul microcontrollore. Si noti che i componenti per il termometro e per il controllo di potenza DC ad altri dispositivi sono stati rimossi per chiarezza.es / ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Saldare il 6-pin, 10-pin, e le due connettori maschio femmina 8 pin nei fori attraverso-sui lati del PCB in modo tale che possono essere impilati in cima al microcontrollore.
  2. Saldare il 100 nF e 10 condensatori uF alle loro posizioni contrassegnate sul PCB, rilevando che il terminale negativo del 10 uF condensatore (terminale corto) deve essere collegato al foro passante contrassegnato con un segno negativo.
  3. Saldare il driver del LED al 2 da 12 serie di fori passanti, con la rientranza sul driver lontano dal fori passanti riservate alla matrice di LED.
  4. Saldare 2 colonne di connettori maschio maschi per fori attraverso marcate per la matrice di LED, e tagliare le estremità di questi sotto la basetta tale che essi non ostacolare il microcontrollore. Collegare questi per due strisce 8 fili di ponticelli femmina / femmina. Collegare un secondo gruppo di maschiconnettori maschio alla altra estremità dei ponticelli.
  5. Inserire la matrice di LED sulla mediana della basetta, e quindi inserire la seconda serie di connettori maschio alle colonne su entrambi i lati della matrice. Assicurarsi che i collegamenti elettrici sono le stesse come se la matrice di LED era stato collegato direttamente al circuito stampato con l'etichetta della matrice corrispondente alla colonna etichettata di fori passanti.
  6. Clip fuori un passaggio di un colpo di testa a 3-pin femmina e tagliare i restanti 2 perni con i tagliatori di filo, in modo tale che può andare bene nei due fori passanti etichetta "R1" e non ostacolare il microcontrollore. Saldare questo. Collegare i due perni saldati inserendo una resistenza 1 kOhm nell'intestazione pin.
    Nota: Il recipiente di coltura viene impilato sulla matrice LED. Se i nastri filo ostacolano la nave, li compensato dalla matrice. Quindi, utilizzare fili nucleo solido per colmare il divario tra i perni della matrice ei perni del nastro filo, in modo che i collegamenti elettrici non change.

4. Installare software e connettersi a Hardware

  1. Stack il PCB sul microcontrollore.
  2. Segui i link nella lista dei materiali per scaricare l'ambiente di sviluppo integrato (IDE) e il codice personalizzato per il microcontrollore.
  3. Collegare il microcontrollore al computer tramite un cavo microscopio AB bus seriale universale (USB). Compilare e caricare il codice personalizzato al microcontrollore.
  4. Scarica Micro-manager 21, 22 e 23 FIJI. Configurare Micro-Manager come un plug-FIJI copiando tutti i file ".dll", la directory "mmplugins", e la directory "mmautofocus" dalla directory in cui Micro-Manager è stato scaricato nella directory "Fiji.app". Inoltre, copiare i "plugins / Micro-Manager" di directory nella directory "Fiji.app/plugins".
  5. Scarica il "BioreactorController.jar" file di into la directory "Fiji.app/mmplugins".
  6. Aperto Micro-Manager da FIJI> Plugin> Micro-Manager> Micro-Studio Manager. Utilizzare l'hardware Configurazione guidata per configurare il software per controllare il microscopio. Includere il dispositivo "FreeSerialPort" nella procedura guidata con l'etichetta della porta a cui è collegato il cavo USB AB.

5. Marca e caratterizzare la custodia a prova di luce per il recipiente di coltura

  1. Stack tre pin 8 prese IC come componenti sulla basetta ad ogni angolo della matrice di LED tale che il recipiente di coltura può poggiare su di loro sopra la matrice.
  2. Fissare una porzione di carta diffusione sotto lo strato superiore delle prese, tale che la luce colpisce il recipiente di coltura dalla matrice LED è diffusa.
  3. Tagliare tre 8 "da 6" porzioni di schiuma nera. Tagliare una porzione che è la stessa dimensione della basetta elettronica (2.3 "x 3.5") dall'interno del primo two ed una porzione che è la dimensione del rettangolo fatta dai prese IC (0,9 "x 1.8") dall'interno del terzo. Stack questi strati sulla matrice di LED tale che lo strato finale contenente la "x 1.8" apertura 0,9 giace anche con la parte superiore delle prese IC, e circonda la matrice di LED.
  4. Tagliare un foglio aggiuntivo di schiuma nera a metà per fare un rettangolo 6 "da 24". Stendere questo in una colonna cava di schiuma nera che il recipiente di coltura può essere inserito in con spazio per i tubi e fili, in modo che questo termicamente e otticamente isolare il recipiente di coltura.
  5. Centra la colonna cava di schiuma nero sopra la matrice di LED, e segnare il confine della colonna sullo strato di schiuma nera sotto di essa. Questo confine segnerà dove dovrebbe essere centrato in futuro.
  6. Tagliare un 3 "x 3" porzione di schiuma nera. Utilizzare questo seguito come un coperchio che può essere attaccata alla parte superiore della colonna per bloccare la luce esterna.
  7. Fissare il sensore di potenza fotodiodo a th e la coltura tappo del vaso con del nastro adesivo, fissare il tappo e inserire il recipiente di coltura nel recinto.
  8. In Micro-Manager, andare al Plugin> bioreattore Controller. Impostare la matrice per illuminare in un sottoinsieme della gamma di possibili intensità a S 30 intervalli.
  9. Registrare le intensità luminose come visualizzato sulla console misuratore di potenza collegato al sensore di potenza. Queste misure consentiranno l'intensità effettiva della luce di essere noto quando viene impostato il numero di LED che si accendono e l'attuale ampiezza d'impulso modulata (PWM) per quei LED.

6. Preparare il recipiente di coltura

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Figura 6: collegamenti nave. Questo diagramma mostra come la nave e tubi dell'apparecchio deve essere collegato prima di essere sterilizzati in autoclave.blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Mark l'altezza corrispondente a ogni 2 mL incremento di liquido nella gamma di 10 mL e 30 mL nel recipiente di coltura. Inserire 10 ml di acqua deionizzata sterile, segnare il livello di acqua, aggiungere 2 mL, segnare il livello dell'acqua, e ripetere fino a quando il livello di 30 ml è segnato. Coprire le marcature con nastro adesivo trasparente in modo che essi non sono facilmente rimossi, e smaltire il liquido.
  2. Inserire l'estremità lunga della porta alluminio attraverso la guarnizione, nel recipiente di coltura. Avvitare il tappo.
  3. Coprire un outlet port breve alluminio con 1/16 tubazione "ID silicio. Inserire l'estremità distale inserendo un luer lock femmina e quindi il collegamento di un connettore luer lock maschio. Questa uscita è complementare, e non verrà utilizzato (tubo 6 in figura 6 ).
  4. Collegare due segmenti brevi di 1/16 "tubo in silicone ID con le serrature luer maschio e femmina. Collegare un'estremità alla presa di porta di breve alluminio e collegare l'distal fine con un luer maschio e femmina luer spina della serratura. Il vaso viene inoculato attraverso questo tubo (tubo 7 / 7,1 in figura 6).
  5. Collegare due 1/16 "tubi d'identità alle estremità del 1/16" ID tubazione peristaltica e connettori. Collegare un'estremità a una porta in alluminio breve e l'altra (tubo 4 in figura 6). Successivamente, questo sarà collegato al pallone media.

7. Preparare il supporto Flask

  1. Collegare un "tubo di diametro interno (ID) silicone alla porta di alluminio più lungo. Il tubo deve essere abbastanza a lungo per raggiungere il pallone media. Collegare un 1/8" 1/16 luer lock ID maschio a un breve segmento di 1/16 " tubazione ID, collegare questo al tubo precedente ,, e quindi inserire questo breve segmento nel tappo di gomma sul pallone supporto (tubo 3 in figura 6).
  2. Bloccare il tubo. Questo collegamento permette all'aria di fluire dal pallone supporto al recipiente di coltura. Quando il pallone supporto viene poi pompata con ariad questo tubo è sbloccata, la cultura sarà misto, aerato e mantenuto ad una pressione positiva dalle bolle in arrivo.
  3. Inserire un "tubo ID sufficientemente lungo per raggiungere il fondo del pallone nel tappo, attraverso cui verranno trasferiti media. Collegare un'altra 1/16" 1/16 tube ID a questo, e quindi un tubo 3/16 "ID per che. Collegare questo con un "ID lock femmina 3/16 luer e un tappo luer lock maschio (tubo 1 / 1.1 in figura 6).
  4. Il terzo foro nel tappo deve essere riempito con un breve segmento di 1/16 "tubazione ID, collegato ad altri due segmenti di tubo diametro medio e collegato all'estremità distale (tubo 2 / 2,1 in figura 6). Questo verrà collegato ad una pompa a vuoto e successivamente ad una pompa acquario.
    NOTA: Se il tubo non può adattarsi facilmente attraverso i fori del tappo di gomma, tagliare le estremità del tubo ad un'inclinazione. Poi, l'estremità inclinata che viene spinto attraverso il foro può essere utilizzato per tirare il resto attraverso.

  1. Inserire un luer lock maschio in un segmento di 1/16 "tubi in silicone ID, e quindi inserire saldamente 0.022" (PTFE) tubazione ID politetrafluoroetilene. Separatamente, utilizzare un blocco luer femmina ad un 1/16 "ID tubo. Poi, filo un'estremità lungo il tubo di PTFE per collegare le serrature e l'altra ad una porta di alluminio breve (tubo 5 in figura 6).
  2. Collegare il "tubo ID silicone al 1/50" 1/50 esposto tubo e connettori peristaltica ID. Per questo, collegare tre segmenti di 1/50 "tubi ID e due segmenti di 0,022" tubi in PTFE ID, alternandoli. Collegare questo al pallone effluente via 1/16 "tubazione ID (tubo 5 in figura 6).
  3. Collegare un'estremità di un tubo 1/16 "ID silicone al tubo secondo più lungo del porto di alluminio e l'altra estremità al pallone effluente. Questo tubo di alluminio imposta il volume cultura e la cultura eccesso trabocca nel contenitore effluente (tubo 8 in
  4. Autoclavare il gruppo coltura a 121 ° C e 15 psi (sterilizzazione generale) per 30 min.
    Nota: I tubi attraverso cui viene riempito il pallone di supporto, attraverso il quale il matraccio supporto viene aspirata, e attraverso la quale il recipiente di coltura viene inoculato avere più segmenti di tubo in modo che se il segmento distale è contaminata, può essere rimosso per rivelare una sterile segmento.

9. Preparare il canale Microfluidic

  1. Mescolare polidimetilsilossano (PDMS) e catalizzatore in un rapporto 9: 1. Degas e versare sullo stampo maestro di silicio.
  2. Curare il PDMS per 2 ore a 65 ° C e poi tagliare dalla maschera con una lama di rasoio. Tagliare intorno alle PDMS finché non si sgancia dallo stampo. Evitare di spingere verso il basso e la rottura del wafer fragili.
  3. Utilizzare un foro di 1,2 millimetri ID biopsia perforatore a perforare ad entrambe le estremità del canale.
  4. Legame plasma il PDMS al vetro di copertura 24.
  5. Nastro il lungo estremità del vetro di copertura al telaio in alluminio appoggio in modo tale che il canale PDMS è centrato sul telaio in alluminio, e poi cuocere i PDMS ancora per 2 ore a 65 ° C.

10. Fill Media Flask

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Figura 7: Aggiunta di media. Questo diagramma mostra come i media dovrebbero essere vuoto filtrato nel pallone media. Essa assicura che il supporto rimane sterile. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Fare mezzi appropriati. Se il sistema di coltura continua sarà gestito come un chemostat, utilizzare supporti limitate per una specifica sostanza.
    NOTA: Esempi di composizione standard dei supporti per gli studi con S. cerevisiae sono stati precedentemente pubblicati 25,= "xref"> 26, 27, 28, 29.
  2. Fissare il filtro a vuoto per un flacone da 100 ml, togliere la copertura dell'ugello, quindi rimuovere la spina bianca dal capezzolo del filtro a vuoto con una pinzetta sterile.
  3. Collegare il tubo di silicone 3/16 "ID per il capezzolo, altro tubo libera del pallone media per una pompa a vuoto (tubi 1 e, 2 in figura 7, rispettivamente), e assicurarsi che il tubo di collegamento del pallone media per il recipiente di coltura viene bloccato chiuse (tubo 3 nella Figura 7).
  4. Riempire il filtro con i media, accendere la pompa del vuoto, e poi filtrare il resto dei media. Bloccare il tubo in silicone 1/16 "ID collegata al vuoto (tubo 2 in figura 7) e spegnere la pompa del vuoto.
  5. Rimuovere le leurs dal segmento intermedio di 1/16 "tubo ID collegato alla pompa a vuoto in modo che una estremità incontaminato del tubo è accessibile. Inserire the blu fine di un filtro dell'aria siringa sterile in questo tubo.
  6. Bloccare il tubo 3/16 "ID silicone (tubo 1 in figura 7) e scollegare il luer maschio da esso. Staccare la spina dalla luer femmina del tubo di ingresso media del recipiente di coltura. Collegare questi maschili e femminili Luers per consentire ai media di essere pompata nel recipiente di coltura.
  7. Rimuovere il filtro a vuoto e tappare la bottiglia di media che è stata allegata al filtro a vuoto 100 mL.
  8. Un giorno prima del recipiente di coltura viene inoculato, inoculare una singola colonia del microbo optogenetic in una provetta con 4 ml di media raccolti nel passaggio precedente, e lasciate crescere durante la notte a 30 ° C o temperatura di crescita ottimale temperatura della coltura con agitazione.

11. Montare l'apparecchiatura Intorno al microscopio

  1. Posizionare il gruppo coltura continua vicino al microscopio con i media boccetta più alto del recipiente di coltura e la efflupallone ent inferiore del recipiente di coltura, in modo tale che il tubo composto da segmenti di 0,022 "tubi in PTFE ID (tubo 5 in figura 6) può raggiungere la fase microscopio. Trovare nastro adesivo lungo i tappi di gomma sul pallone di supporto e contenitore effluenti.
  2. Scollegare le estremità del 0.022 "ID tubazione PTFE da 1/50" tubo ID silicone li collegano (tubo 5 in figura 6), e collegare questi fini in ingresso e uscita del dispositivo microfluidico.
  3. Collegare l'estremità bianca del filtro dell'aria della siringa alla pompa dell'acquario. La pressione dell'aria spingerà supporto nel recipiente di coltura.
  4. Quando il supporto raggiunge il livello del porto effluenti, avvolgere il tubo "dispositivi di identificazione ingresso e connettori attorno alla pompa peristaltica lenta (tubo 4 in Figura 6) e 1/50" 1/16 campione tubo di uscita ID e connettori intorno veloce pompa peristaltica (tubo 5 in figura 6).
  5. Aerare il supporto per lo sbloccaggio l'aria tuessere compreso tra il fiasco dei media e recipiente di coltura.
  6. Nastro il pad riscaldamento e termometro per il recipiente di coltura in modo che la sua temperatura può essere controllata. Avvolgere il tubo media di tutto il recipiente di coltura quindi i media entrano saranno alla stessa temperatura del recipiente.
    NOTA: La corrente PWM al pad riscaldamento è regolato dal microcontrollore che utilizza l'ingresso dal termometro per mantenere il recipiente di coltura alla sua temperatura nominale.
  7. Inserire il recipiente di coltura nel recinto di schiuma nera sopra la matrice di LED, e assicurarsi che i tubi non vengano schiacciati.
  8. In Micro-Manager, andare al Plugin> bioreattore Controller. Impostare la "percentuale media pompa" campo per 0,1 e il "rapporto della pompa di esempio a" field a 0. La velocità di flusso sarà molto bassa, ma maggiore della velocità di evaporazione.
  9. Fissare il tubo di aria in entrata tra il pallone media e recipiente di coltura. Togliere il tappo dal tubo di inoculazione (tubo 7 in figura
  10. Coprire il contenitore in modo che la luce non penetra, e lasciare che la cultura crescere durante la notte.

12. Calibrare il pompaggio Tariffe

  1. In Micro-Manager, andare al Plugin> bioreattore Controller. Impostare il "rapporto di supporti pompa su" campo per 0,5 e il "rapporto di pompa di esempio a" campo a 0.
  2. Scollegare il tubo di troppo pieno dal pallone effluente (tubo 8 in figura 6) e il tubo di campionamento dal pallone effluente (tubo 8 in figura 6) e raccogliere effluenti in recipienti separati. Raccogliere effluente per 1 ora, inizio dopo le pompe sono state per 15 min.
  3. Calcolare la portata media nel recipiente di coltura dal volume raccolto nel recipiente come:
    figure-protocol-7
  4. Regolare il valore del "rapporto della pompa di supporto a" campo da questa stima lineare:
    figure-protocol-8
    dove
    figure-protocol-9
  5. Scorrere questa procedura di calibrazione finché la differenza tra la portata desiderata e la portata misurata è <0,2 ml / h, in cui la portata è in media su un periodo di 1 h.
  6. Aumentare il valore del "rapporto di campionamento sul campo" e calibrare in modo analogo fino a circa 4/5 del volume th sbarco l'incubazione viene pompato dalla pompa di campionamento e circa 1/5 del volume lascia attraverso il porto di overflow.
  7. Lasciate che la densità di cultura nel apparecchiatura per le colture continuo equilibrare in queste condizioni durante la notte.
    NOTA: Se le portate obiettivo non può essere raggiunto, il cambiamentoil tubo della pompa peristaltica. Il liquido viene pompato ad un tasso superiore quando si utilizza più grandi tubi di diametro. Seguire passo 14 e poi tornare al punto 8.4.

13. microscopio Immagini Raccogliere di microbi coltivate

  1. Riempire la fase Position List di Micro-Manager con un insieme di posizioni non sovrapposte in cui le immagini di cellule pompati nel canale microfluidico saranno nel piano focale.
  2. Aprire il plugin "bioreattore Controller". Selezionare la rotta desiderata tempo matrice di LED, i canali di imaging, e le altre impostazioni sperimentali dalle istruzioni. Raccogliere e analizzare le immagini.
  3. Mentre l'esperimento funziona, assicurarsi che il supporto nel pallone mezzi rimane chiaro. Se è nuvoloso, allora è stato contaminato.

14. Post-esperimento

  1. Smaltire i media, la cultura di cellule in eccesso e degli effluenti.
  2. Riempire il matraccio media con 200 ml di 20% EtOH miscelato con acqua deionizzata. Eseguire il chemostat come aveva in precedenzastato eseguito durante l'esperimento per lavare i detriti cellulari e dei media.
  3. Quando la soluzione di alcool è drenata dal pallone media, smontare completamente il chemostat.
  4. Lavare vetro e tubi con acqua tiepida e un detergente delicato, e risciacquare abbondantemente con acqua deionizzata. Lasciare asciugare.
  5. Aprire il file "microcontrollerRecords.csv" per rivedere la temperatura e lo stato matrice di LED nel corso dell'esperimento, il file "Summary.csv" per esaminare i dati di sintesi di ogni set di immagini ed i "risultati .csv" file per esaminare i dati di sintesi ogni ROI di ogni periodo di tempo, dove n è il n ° set di dati.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo apparecchio è stato utilizzato per stimolare una cultura di S. cerevisiae esprimere proteina fluorescente gialla (YFP) in risposta alla luce blu tramite un sistema di trascrizione inducibile optogenetic basata sulla coppia proteine CRY2 / CIB1 30. Le cellule sono state coltivate chemostatically nei media fosfato limitata, con un tasso medio di diluizione di 0,2 ± 0,008. Limitazione fosfato è comunemente usato in esperimenti S. cerevisiae c...

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Discussion

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Abbiamo progettato questo apparecchio ogni esigenza. Tutto il codice utilizzato è gratuito e open-source. Il processo di analisi delle immagini di default per le cellule del segmento è semplice e viene eseguito rapidamente. Analisi personalizzata può essere attuata facendo registrare input dell'utente mentre analizzando un'immagine rappresentativa con l'interfaccia grafica utente FIJI, convertendo l'ingresso a uno script BeanShell, e quindi impostando il plugin per chiamare lo script. Quando viene chiama...

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Vorremmo riconoscere Molly Lazar e Veronica Delgado per l'assistenza in fase di test del protocollo, Kieran Sweeney per utili discussioni e l'editing, e Taylor Scott, My An-adirekkun, e Stephanie Geller per la lettura critica del manoscritto. Megan Nicole McClean, Ph.D. detiene un premio alla carriera al interfaccia Scientifico del Fondo di Burroughs Wellcome.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Un manuale di laboratorio completoregolarmente aggiornato è disponibile nella sezione " File chemostatici optogenetici" Repository GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). Ciò include anche una descrizione dello stampo microfluidico utilizzato per generare i risultati rappresentativi.
Fritzing Design ViewerFritzingNAIl software gratuito e open-source per visualizzare e modificare i progetti di circuiti stampati di tipo .fzz è disponibile all'indirizzo "http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 (Atmega328 - assemblato)Adafruit50. 1 richiesto.
Arduino Kit di connettori impilabiliSparkFun Electronics10007Connettori pin femmina per il collegamento di PCB a microcontrollore. 1 richiesto.
Saldatore regolabile 30W 110V - XY-258 110VAdafruit180Per effettuare collegamenti elettrici al PCB. 1 richiesto.
Supporto per saldatoreAdafruit150Per effettuare collegamenti elettrici al circuito stampato. 1 richiesto.
Mini bobina di saldatura - 60/40 piombo rosin-core saldatura 0,031" diametro - 100gAdafruit145Per effettuare collegamenti elettrici al PCB. 1 richiesto.
0,1 μ Condensatore FSparkFun ElectronicsCOM-08375Stabilizza la tensione nel PCB. 1 richiesto.
10 μ Condensatore FSparkFun ElectronicsCOM-00523Stabilizza la tensione nel PCB. 1 richiesto.
MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver - MAX7219DriverMaxim MAX7219CNG. 1 richiesto.
Presa IC a 8 pinMouser Electronics575-14430816 richiesti. Questi saranno impilati uno sopra l'altro per sostenere il recipiente di coltura sopra la matrice LED.
Presa IC a 24 pinMouser Electronics535-24-3518-10Opzionale. Utilizzare questo per collegare in modo reversibile il driver MAXIM 7219CNG al PCB.
Multimetro digitaleAdafruit2034Per la risoluzione dei problemi elettronici. 1 richiesto.
Connettori a strappo - Maschio a 40 pin (centrato lungo, PTH, 0,1")SparkFun ElectronicsPRT-12693Connettori maschio per matrice LED collegata a circuito stampato. Le estremità possono essere tagliate con tronchesi. 1 set richiesto.
Tronchesi diagonali a filo Adafruit152Per la rifilatura di connettori lunghi e il taglio di cavi di alimentazione. 1 richiesto.
Cavi per ponticelli femmina/femmina di alta qualità - 40 x 12" (300 mm)Adafruit793per il collegamento della breadboard alla matrice LED. Può essere collegato end-to-end con connettori maschio per essere più lungo. 1 obbligatorio.
Breadboard di dimensioni ridotteAdafruit64La matrice LED si collegherà a questo e il recipiente di coltura si appoggerà sopra di esso.
Miniatura 8x8 Blu LED MatrixAdafruit956Sorgente luminosa. La lunghezza d'onda dominante è 470 nm (blu). 1 obbligatorio. Sono disponibili matrici LED miniaturizzate alternative dello stesso fornitore con lunghezze d'onda dominanti: 624 nm (rosso), 588 nm (giallo), 525 nm (verde), 572 nm (giallo-verde) e bianco.
Connettore impilabile a 3 pinSparkFun Electronics138758 richiesto.
Kit resistori - 1/4W (500 totali)SparkFun Electronics10969Per l'elettronica. 1 richiesto.
  IRL520N MOSFETInternational RectifierIRL520NInterruttore di regolazione della tensione per il controllo della corrente continua. 4 richiesti.
Cavo di collegamento - Assortimento (Solid Core, 22 AWG)SparkFun ElectronicsPRT 11367Cavo per elettronica. 1 richiesto.
Alimentatore switching 5V 2A (2000mA) - UL ListedAdafruit276Alimentatore per il pad riscaldante e Arduino. 2 richiesto.
Adattatore di alimentazione switching regolato 12 VDC 1000mA - Adafruit798UL Per pompe peristaltiche. 2 richiesti.
Termoforo elettrico - 10cm x 5cmAdafruit1481Per riscaldare il bioreattore. 1 richiesto.
Pompa peristaltica a portata variabile a bassa portataFisher Scientific13-876-1Per il pompaggio di fluidi. 1 richiesta
Pompa peristaltica a portata variabile a media portataFisher Scientific13-876-2Per il pompaggio di colture. 1 richiesta.
Adattatore di alimentazione switching regolato 9 VDC 1000mA - Adafruit63UL per alimentazione a microcontrollore. Ordine 1.
Sensore di temperatura digitale DS18B20 impermeabile ad alta temperatura + extraTermometro Adafruit642per il bioreattore. 1 richiesto.
MicromanagerMicromanagerNAIl software gratuito e open source per il controllo del microscopio è disponibile all'indirizzo "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJIImageJNAIl software gratuito e open source per l'analisi delle immagini è disponibile all'indirizzo "http://fiji.sc/"
Arduino Integrated Development EnvironmentArduinoNAL'IDE gratuito e open source è disponibile all'indirizzo "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
Codice personalizzatoGitHubNAIl codice del microcontrollore personalizzato e il plug-in "Bioreactor Controller" sono disponibili nella " File chemostatici optogenetici" Repository GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Cavo USB da A a B - 6 piediSparkFun ElectronicsCAB-00512Utilizzato per scaricare i dati sul microcontrollore. 1 richiesto.
bioreactorTimecourse_example.csvGitHubNAIl vantaggio di caricare i valori della matrice LED da un file CSV è che un programma può essere chiamato dal plug-in per aggiornare tali valori in base ai risultati dell'analisi delle immagini e tali valori possono essere ricaricati sul microcontrollore, consentendo il controllo del feed-back. È disponibile dal " File chemostatici optogenetici" Repository GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Gel Tota-frost (carta per diffusione)B& HB& H # LOFSFTL
MFR # T1-72		Per matrice LED. 1 richiesto.
Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24inGrainger, inc20JL37Schiuma nera per la recinzione del recipiente di coltura. 4 richiesti.
Sensore di potenza a fotodiodo standard, Si, 200 - 1100 nm, 50 mWThorlabsS120VCPer misurare l'intensità della luce. 1 richiesto.
Nastro adesivoFisher Scientific159015NPer l'etichettatura e il fissaggio di componenti sciolti. 1 richiesto.
Console compatta per contatori di potenza ed energia, digitale LCD da 4"ThorlabsPM100DPer misurare l'intensità della luce. 1 richiesto.
Flacone in vetro per ibridazione GL45 da 100 mlBellco Glass, Inc.(7910-40150)Recipiente del bioreattore. 1 richiesto.
Assemblaggio a sei porteBellco Glass, Inc.Personalizzato Per il recipiente del bioreattore. Specifiche del tubo: .125" OD x .055" ID. Porta A: 1.0" di lunghezza sopra il tappo e sul fondo del tubo. Attacchi B,C,E,F: 1,0" di lunghezza sopra lo slug del cappuccio, 33 mm di lunghezza sotto. Porta D: 1,0" di lunghezza sopra il proiettile del tappo, 65 mm molto sotto. 1 obbligatorio. Include un tappo a vite aperto in polipropilene da 45 mm di diametro e una guarnizione in silicone bianco per garantire una tenuta ermetica tra il tappo e il recipiente.
Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 pollici, confezione da 3AmazonB0009F3P3UScotch trasparente. Questo è disponibile da molti altri fornitori. Viene utilizzato per coprire le marcature sul recipiente di coltura e per fissare il vetro di copertura con il canale PDMS al telaio di supporto in alluminio.
1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Parete Tygon Tubi in silicone sanitariStati Uniti Plastic Corp.57288Tubi. ~25' richiesto.
Tappo in gomma bianca Cole-Parmer Twistit, misura 10pallone per terreni e tappo per palloni di effluentiCole-ParmerEW-62992-32
Pallone da laboratorio da 2 litriPyrex4980Pallone per terreni e pallone per effluenti. 2 richiesti.
Rubinetto diurnoFisher Scientific5867Per pizzicare i tubi chiusi. 3 richiesti.
Tubo di ricambio 1/16" IDProdotti tracciabili3372Le pompe peristaltiche vengono fornite con un set di tubi, ma si usurano dopo settimane di utilizzo.
Tubo di ricambio 1/50" IDProdotti tracciabili3371Le pompe peristaltiche vengono fornite con un set di tubi, ma si usurano dopo settimane di utilizzo.
Luer maschio con anello di bloccaggio x portagomma da 1/16", nylon, 25/pkConnettori Cole-ParmerEW-45505-00. ~10 luer sono richiesti.
Luer maschio con anello di bloccaggio x portagomma da 1/8", Nylon, 25/conf.Connettori Cole-ParmerEW-45505-04. 5 richiesti, uno per ogni foro di tappo in gomma da riempire con il tubo.
Adattatore femmina luer x 1/16" portagomma, nylon, 25/pkConnettori Cole-ParmerEW-45502-00. ~10 luer richiesti.
Adattatore femmina luer x 3/16" portagommaCole-ParmerEW-45502-08Connettori. ~10 luer richiesti.
Cole-Parmer Luer Accessorio, Femmina Luer Cap, Nylon, 25/PkCole-ParmerSC-45502-28
Cole-Parmer Luer Accessorio, Maschio Luer Lock Plug, Nylon, 25/PkCole-ParmerEW-45505-56
Microbore PTFE Tubo, 0,022" ID x 0,042"OD, 100 ft/rollCole-ParmerEW-06417-21Tubo. 1 rotolo richiesto.
Tubo in silicone polimerizzato al platino Masterflex, L/S 13,Cole-ParmerEW-96410-13. ~25' richiesto.
3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Parete Tygon Tubi in silicone sanitariStati Uniti Plastic Corp.57293Tubi. ~1' richiesto.
Filtro sottovuotoFisher Scientific974107Filtro sottovuoto Nalgene per mezzi filtranti sterili.
Aquel Oxy-Boost 200Rena Aquatic SupplyAP200Pompa d'aria a flusso regolabile a doppio diaframma per l'aerazione e la miscelazione di fluidi. 1 richiesto.
0,2 μ m filtro per siringhe a poriCorning International431229Ciò garantisce che l'aria proveniente dalla pompa dell'acquario non contamini l'apparecchio. 1 richiesto.
Slygard 184 Kit Elastomero SiliconicoDow CorningSlygard 184Per dispositivo microfluidico. 1 richiesto.
Rasoio di Sicurezza Americano GEM Scientific Lame da Barba a Taglio SingoloFisher Scientific17989000Per il taglio di tubi e PDMS. 1 lama richiesta.
Perforatrice Harris Uni-Core ID 1,2 mmSigma-AldrichWHAWB100028 ALDRICHPer punzonatura ingresso/uscita in dispositivo microfluidico. 1 richiesto.
Vetro di copertura del microscopio 22x60-1.5Fisher Scientific12-544-GPer dispositivo microfluidico. 1 richiesto.
Telaio rettangolare in alluminio con finestra quadrataCustomCustomPer supportare il canale microfluidico. Dimensioni esterne: 3 pollici x 1,25 pollici.
Dimensioni interne (parte ritagliata): 7/8 pollici x 7/8 pollici
Spessore: ~1/32 pollici
e Microcontrollore LED Nastro di filo omologato omologato Tappo per . tubo da 25 piedi

References

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